前言  細胞劃痕實驗的基本概念：

細胞劃痕實驗（Wound Healing）是一種操作簡單，經濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外實驗方法。這種方法的原理是，當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細胞上劃痕工具制造一個空白區(qū)域，空白區(qū)域的細胞被機械力去除掉了，通過一段時間的培養(yǎng)，觀察細胞向無細胞區(qū)域遷移的情況，通過測量細胞的遷移距反映細胞的遷移能力。

細胞遷移的重要性

細胞遷移(cell migration)：也稱為細胞移動、細胞爬行或細胞運動，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產生的移動。

　　它參與到很多生理和病理的活動中，如下：

　　免疫：如淋巴細胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關鍵之一;

　　炎癥：炎癥反應重要的功能是將白細胞送到炎癥灶，白細胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用;

　　腫瘤轉移：腫瘤轉移是腫瘤惡化后常見的活動，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統實現遠處轉移;

　　損傷修復：當機體發(fā)生損傷時，免疫細胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血;

　　胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

細胞劃痕實驗的基本原理

細胞劃痕實驗是目前測定細胞遷移運動與修復能力的常用也是簡單的方法，基本原理是：在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗（Wound-Healing Assay），廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對細胞遷移和修復的影響。

細胞劃痕實驗步驟

標記六孔板

用marker筆在六孔板底部畫平行線，平行線之間的距離0.5cm，為了保證后續(xù)拍照位置是相同的；

鋪板

細胞重懸鋪板，密度控制在第二天長滿，若過夜后細胞完全長滿，也可以適當延長培養(yǎng)時間，但如果細胞密度已經很大，盡量重新鋪板，因為可能過一 天后細胞太滿，會導致細胞狀態(tài)逐漸變差，后續(xù)細胞可能不遷移而是凋亡；

制造劃痕

第二天用直尺比著使用10ul槍頭制造劃痕，劃痕方向與標志線垂直，保持力度一致，盡量一次性劃完，然后PBS沖洗3次，洗去漂浮的細胞

為了減少細胞增殖所引起的假陽性結果，降低細胞增殖對實驗結果的影響，將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基和低血清培養(yǎng)基（FBS＜2%繼續(xù)培養(yǎng)細胞）；

拍照

拍照前用PBS沖洗3次，一般認為24h為細胞的一個周期，所以檢測時間不要超過一個周期的時間，按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，

選擇合適時間點拍照，如0h，6h，12h，24h后取出細胞于顯微鏡下拍照。

數據處理與繪圖

使用image j分析每個時間點劃痕的寬度或劃痕的面積。

使用image pro plus 可以測量劃痕位置的面積和高度，將面積除以高度可以得到平均的劃痕寬度，將0 點的劃痕寬度減去實驗結束時的劃痕的寬度，得到的就是細胞遷移的距離，然后使用距離值按如下公式進行計算migration index。

計算公式如為：migration index=migration distance of test group/migratance distance of control group

將3 次獨立重復的數據都分析完后進行統計分析并繪制柱狀圖。

常見問題解答

1. 劃痕實驗為什么一般選擇6孔板？

因為6孔板大小適中，可保證有相當距離的平直劃痕，便于觀察；當然若是需要高通量初篩時，也可以用12或者24孔板。

2. 為什么細胞的接種密度原則為：過夜為100%融合？

若過夜后細胞未100%融合，雖可以適當延長培養(yǎng)時間，但因細胞密度已經很大，所以細胞狀態(tài)會逐漸變差，后續(xù)細胞可能不遷移而是凋亡。

3. 如何降低細胞增殖對遷移造成的假陽性結果？

① 使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細胞增殖對實驗結果的影響；② 一般認為24h為細胞的一個周期，在選取合適的時間點（6，12，24h）檢測劃痕寬度時，不要超過細胞一個周期的時間；③  如果要單純考慮細胞遷移，可以先用絲裂霉素（1μg/ml）處理1h，抑制細胞的分裂。

4. 如何確保拍照的觀察點？

按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，劃痕一次與5條定位線相交，就有10個可固定監(jiān)測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。

5. 細胞不遷移怎么辦？

避開細胞狀態(tài)的影響，需要考慮細胞自身的遷移能力，并非所有細胞都適合劃痕實驗，以乳腺癌為例，乳腺癌細胞MCF-7幾乎很難遷移，而MDA-MB-231具有很強遷移性。

6. 細胞劃痕法有哪些不足？

① 適用的細胞類型范圍小，一是需要遷移強的細胞，而且對無血清的環(huán)境有較強的忍受力（至少24h）然而很多腫瘤細胞系在無血清培養(yǎng)下，12h細胞凋亡就超過50%，因此細胞劃痕法對部分腫瘤細胞并不適用。② 自身操作的實驗誤差，如劃痕距離不一致等。

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